PLANT INITIATION

  

PLANT INITIATION

Brood quarantine, plant sterilization, and explanatory planting

(ESHA FLORA X IAAS IPB)

Initiation is a technique of obtaining sterile cultures by taking plant explant cultures that go through various sterilization processes. Generally the initiation stage takes from the eyes of the plant buds. Explant sterilization, that is, the process of removing microbes (bacteria, fungi) from plants. The principle of sterilization should be obtaining sterile plants, the right dosage in order for the plant to live and the microbes to die. The most difficult stage of this initiation process is explant sterilization because each plant contains microbes, especially plants to be cultured growing in the tropics. Generally, the percentage of success of the initiation process ranges from 10%.

 

The stages of initiation are as follows ;

1. Brood quarantine

2. Sterilization of pre-laminar explants

3. Sterilization in Laminar

4. Planting

 

1. Parent Quarantine

Parent quarantine is carried out to eliminate the presence of endophytic microbes, fertilize the endurance of the mother plant, and accelerate cell growth. The actions that need to be taken at this stage include:

1. Administration of ZPT or hormones such as auxins, cytokinins, and gibberellin.
2. Application of fungicides and bactericides, such as benlox (fungicide) and agrept (bactericidal).
3. Application of inorganic fertilizers such as gandasil, growmore, and other NPK fertilizers. If the plant is given organic fertilizer, it is worried that it will multiply endophytic bacteria so that inorganic fertilizers are used to strengthen the condition of the broodstock.

 

2. Pre-laminar sterilization

-          Cut into pieces of explants, part of the leaves are cleaned with 70% alcohol

-          Flow the water for 15–30 minutes to remove phenols from the plants and also remove microbes that are still present in the plant explants.

-          Kocok dengan larutan fungisida 0.2 gram dan bakterisida 0.2 gram dalam 100 ml selama 30–60 menit. Tanaman kehutanan membuttuhkan larutan fungisida dan bakterisida yang lebih banyak, yakni umumnya 2 gram dalam 100 ml selama 1 jam.

-          Bilas hingga bersih

-          Rendam dengan larutan antibiotik (Streptomycin) 10 ml dalam 90 ml air steril, lalu di aerator selama 1 jam hingga 16 jam. Aerator yang digunakan di Esha Flora dimodifikasi, aerator dimasukkan ke dalam wadah yang ditutup dengan Hepa filter . Hepa merupakan filter dari laminar yang fungsinya untuk menyaring mikroba sehingga angin atau udara yang masuk bersifat steril.

 

3. Sterilisasi di Laminar

-          Tanaman dibilas air steril

-          Eksplan direndam, kemudian dikocok dalam larutan clorox atau bayclin 15% (7 menit)

-          Perendaman kembali dengan konsentrasi 5% selama 7 menit, dilakukan bertahap agar mengurangi terjadinya kontaminasi dan menghindari terjadi kerusakan jaringan tanaman yang penting.

-          Bilas dengan air steril selama 5 menit

-          Jika tingkat kontaminasi tinggi bisa menggunakan HgCl 10mg/100ml (3-10 meneit). Eksplan yang digunakan pada bagian pucuk muda direndam selama 3 menit sedangkan eksplan yang digunakan pada bagian pucuk tua perendaman bisa mencapai 7 menit .

-          Eksplan dibilas 3 kali dengan air steril masing-masing 5 menit. Harapannya eksplan tanaman benar-benar dalam kondisi steril.

-          Siap ditanam

 

4. Penanaman

Perbedaan penanaman di enkas dan di laminar

-          Enkas : Tidak perlu bunsen dan punya ruang gerak lebih terbatas dibanding laminar, serta ruangan tertutup dan sudah disterilisasi menggunakan alkohol sehingga kemungkinan eksplan terkontaminasi oleh mikroba lebih kecil. Sterilisasi menggunakan alkohol dan air steril yang dicampur dengan betadine.

-          Laminar: Lebih bebas bergerak, dapat menggunakan bunsen untuk pensterilan alat. Selain untuk pensterilan alat bunsen juga digunakan untuk sterilisasi biji anggrek karena inisiasi biji anggrek harus dibakar di dalam laminar. Selain itu, di  laminar juga mempunyai lampu UV yang berguna untuk sterilisasi (membunuh mikroba).

 

 

Proses pengambilan eksplan tanaman

Janda Bolong (Monstera adansonii) dan Puring (Codiaeum variegatum)

 

A.      Sterilisasi luar (sebelum sterilisasi di dalam laminar)

Alat :

1. Gelas ukur
2. Saringan
3. Talenan,
4. Scalpel untuk memotong tanaman.
5. Tisu

Bahan :

1. Air pureit
2. Spray isi alkohol,
3. Fungisida dan bakterisida (masing-masing 0,1 gr + 100 ml air)
4. Deterjen (1 gr larut 100 ml air)
5. Antibiotik yaitu streptomycin (10 ml)

 

Langkah Kerja:

1. Sayat dan ambil batang bertunas Janda bolong, pangkal batang yang berwarna cokelat dan hitam dibersihkan.
2. Untuk tanaman Puring yang diambil ialah daunnya. daun dipotong menjadi bagian-bagian kecil.
3. Kedua eksplan disemprot terlebih dahulu dengan alkohol 70% untuk dibersihkan, kemudian usap menggunakan tisu.
4. Dibersihkan kembali menggunakan air mengalir selama 30 menit
5. Dengan menggunakan pinset, eksplan dimasukkan ke dalam botol berisi deterjen, kemudian botol digoyangkan selama 10 menit.
6. Buang air deterjen, lalu bilas eksplan menggunakan air pureit hingga benar-benar bersih
7. Masukkan eksplan ke dalam botol bakterisida, dan goyangkan botol selama 30 menit
8. Bilas dengan air pureit hingga bersih
9. Kemudian masukkan kembali eksplan ke dalam botol fungisida, dan goyangkan botol selama 30 menit
10. Bilas dengan air pureit hingga bersih
11. Eksplan diberi antibiotik (streptomycin) 10 ml
12. Terakhir dalam proses sterilisiasi luar yakni proses aerator selama 1 jam, proses aerator adalah proses pemberian oksigen kepada tanaman, jika eksplan kurang bersih maka akan muncul busa disekitar eksplan.

 

B.     Sterilisasi dalam laminar

Alat :

1. Tiga botol selai (alkohol + betadine, air steril, dan wadah sampah)
2. Bunsen
3. Cawan petri
4. Pinset
5. Scalpel
6. Tisu steril

 

Bahan :

1. Eksplan tanaman
2. Alkohol
3. Betadine
4. Media tanam
5. Air steril

 

Langkah Kerja :

1. Menyemprot tangan menggunakan alkohol 70% agar tetap steril.
2. Menyiapkan 2 botol selai yang berisi air steril, kemudian memasukkan eksplan ke dalam botol 1 berisi air steril dan dikocok sebanyak 2 kali pengulangan pada botol yang berbeda selama 3 menit. Pengambilan eksplan menggunakan pinset.
3. Menyiapkan larutan HgCl2 10% (10 ml HgCl dicampur dengan 90 ml air steril) yang juga diteteskan tween sebanyak 3 tetes, kemudian eksplan yang sudah disterilkan direndam dan dikocok pada larutan HgCl2 selama 7 menit.
4. Memasukkan eksplan ke dalam air steril, kemudian dikocok selama 5 menit. Proses ini dilakukan sebanyak 2 kali pengulangan pada botol yang berbeda.
5. Memasukkan eksplan ke larutan Clorox 15% atau Bayclin (15 ml Clorox + 85 ml air) kemudian digoyangkan selama 7 menit. Perhatikan kondisi tanamannya apabila sudah memutih kurangi lagi SOP waktunya.
6. Memasukkan eksplan ke dalam air steril, kemudian dikocok selama 5 menit. Proses ini dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan pada botol yang berbeda.

 

Langkah Kerja Penanaman :

1. Menyiapkan cawan petri dan menyalakan bunsen menggunakan korek.
2. Memasukkan eksplan ke dalam air steril, kemudian dikocok selama 5 menit. Proses ini dilakukan sebanyak 2 kali pengulangan pada botol yang berbeda.
3. Cawan petri diberikan betadine dan alkohol 70% kemudian digoyang-goyangkan sampai betadinenya merata (bisa digoyangkan dalam posisi terbalik).
4. Cawan petri dibersihkan menggunakan tisu steril, kemudian cawan petri dibakar menggunakan bunsen.
5. Memasukkan tisu steril ke dalam cawan petri, tisu ini akan digunakan sebagai tempat atau wadah eksplan. Kondisi cawan petri diusahakan harus selalu dalam kondisi tertutup. 
6. Membakar ujung pinset menggunakan bunsen setiap akan digunakan, kemudian pinset tersebut dimasukkan ke larutan betadine. Apabila terdapat bagian ujung eksplan tanaman berwarna putih, maka harus dilakukan pemotongan.

7. Menyiapkan media tanam, air yang ada di media dibuang, kemudian mulut botol  dibakar dengan bunsen dan bagian ujung pinset jangan menyentuh mulut botol atau media tanamnya.
8. Memasukkan eksplan ke dalam media menggunakan pinset, posisi pinset miring, dan posisi tunas Janda bolong menghadap ke atas (tunas di atas) sedangkan eksplan Puring ditanam dengan posisi daunnya langsung ditancapkan atau tulang daunnya yang ditancapkan ke media tanam.

 

+ Proses Wrapping eksplan yang sudah ditanam pada media

Sebelum eksplan dimasukkan pada ruang inkubasi, botol eksplan dibungkus terlebih dahulu dengan plastik wrapping ;

-          Botol selai : hanya dengan membungkus pinggiran tutup botol dengan plastik wrap

-          Botol asi : setelah dikencangkan dengan karet, tutup botol harus menggunakan aluminium foil baru kemudian dibungkus dengan plastik wrap

 

+ Proses pelabelan botol eksplan

Botol eksplan yang siap dimasukkan ke dalam ruangan inkubasi terlebih dahulu diberi label. Adapun ketentuan pelabelan ialah dengan mencantumkan nama tanaman, tanggal inisiasi, media serta eksplan yang digunakan.