Ragam Produk dan Jasa Esha Flora

  

TISSUE CULTURE MEDIA

  

MEDIA KULTUR JARINGAN

(ESHA FLORA X IAAS IPB)

 

Kultur jaringan merupakan salah satu metode dalam pembibitan suatu tanaman yang menciptakan hasil steril dan tentunya hasil yang memuaskan. Kebutuhan dari tanaman itu sendiri terbagi menjadi 2, yaitu kebutuhan dari lingkungan dan kebutuhan media tanam. Kebutuhan lingkungan ini termasuk sinar, Karbondioksida (CO2), Oksigen (O2), kelembaban, sirkulasi udara, dan lain sejenisnya. Sementara itu, kebutuhan media tanam meliputi fisik tempat tumbuh dan zat kimiawi makanan.

Dalam penyiapan media yang optimal tentunya juga memerlukan bahan-bahan khusus agar hasil tanaman yang didapat nantinya dapat tumbuh secara maksimal. Sayangnya, bahan pro analis untuk pembuatan media tanam ini tergolong cukup mahal, seperti contoh sukrosa untuk sumber energi tanaman berharga ratusan ribu. Akan tetapi, beruntung bahan-bahan pro analis ini dapat digantikan oleh bahan teknis/alternatif. Seperti contoh sukrosa tadi dapat diganti dengan gula pasir putih dengan harga belasan ribu saja. Tentu hasil yang didapat dari bahan teknis ini juga tidak kalah dari hasil yang didapat dari bahan pro analis.

Bahan-bahan yang dapat digantikan ini cukup banyak dari sumber energi untuk tanaman kultur jaringan yaitu sukrosa dapat digantikan dengan gula pasir putih. Bahan pemadat dari agar bacto dapat digantikan dengan agar swallow atau agar batangan. Vitamin B1, B6, B12, dan lainnya dapat digantikan dengan vitamin B Kompleks yang ada di pasaran. Arang aktif yang dapat diganti norit. Lalu bahkan sampai antibiotik yang biasanya memakai streptomisin dapat diganti dengan agrept (bakterisida) atau amoksisilin tablet yang biasanya kita konsumsi saat sakit. Tentunya bahan yang digunakan harus melalui proses penumbukan dan penyaringan terlebih dahulu agar hasil yang didapat lebih murni. Ada juga ZPT yaitu zat pengatur tumbuh yang bahan pro analisnya dapat kita ganti juga dengan bahan teknis/alternatif.

 

1. Proses pembuatan media kultur jaringan

Bahan-bahan :

1. Growmore sbg unsur hara
2. Vitamin
3. Asam amino (glycine, pepton)
4. Sumber energi (gula pasir)
5. Bahan pemadat (agar-agar swallow)
6. Air steril / akuades
7. Myo-Inositol

 

Alat-alat :

1. Pipet plastik
2. Pengaduk kaca
3. Timbangan digital
4. Gelas ukur
5. Panci stainless steel
6. Alat pengukur pH (kertas lakmus)
7. kompor

 

            Langkah Kerja :

 

●       Pembuatan Media

1. Timbang Growmore (2 gr/L) menggunakan timbangan digital
2. Growmore yang telah ditimbang dimasukkan ke dalam cerek plastik berisi 500 mL air, kemudian aduk denganpengaduk kaca
3. Campurkan vitamin (5 mg/L) ke dalam cerek, menggunakan pipet plastik 3 mL
4. Campurkan asam amino yakni glycine ke dalam cerek, sebanyak 2 mg/L dari perbandingan 1:1
5. Timbang pepton 100-200 mg/L atau setara dengan 0,2 g/L, dan larutkan dengan sedikit air sebelum mencampurkannya ke dalam cerek. Setelah larut, campurkan ke dalam cerek lalu aduk
6. Timbang myo-inositol sebanyak 0,1 g/L, kemudian campurkan ke dalam cerek dan aduk
7. Campurkan sumber energi yaitu gula pasir sebanyak 30 g/L, jika ada tambahan air kelapa maka takaran gula pasir menjadi 20 g/L. Lalu masukkan ke dalam cerek dan aduk hingga larut
8. Tambahkan air ke dalam cerek hingga genap 1 Liter, lalu aduk kembali.
9. Kemudian cek kadar pH larutan dalam cerek, menggunakan kertas lakmus pH
10. Normal pH yang akan dihasilkan oleh larutan ialah 5.8 hingga 6. Jika larutan terlalu basa maka diturunkan dengan HCl, dan jika terlalu asam maka dinaikkan dengan NaOH.
11. Masukkan zat pemadat yakni agar-agar yang telah ditimbang sebanyak 6 gr/L, ke dalam panci stainless steel
12. Masukkan juga larutan yang telah diracik dalam cerek ke dalam panci, lalu aduk.
13. Nyalakan api kompor dan masak larutan media hingga mendidih sambil diaduk terus menerus
14. Setelah mendidih, matikan api kompor

 

●       Sterilisasi Media

Bahan-bahan :

1. Larutan media yang telah selesai dibuat

 

Alat-alat :

1. Beberapa jenis botol
2. Plastik PP ukuran 10x10
3. Gelang karet
4. Autoklaf
5. Dendeng
6. Kompor

 

 

Langkah sterilisasi:

1. Siapkan beberapa jenis botol yang telah disterilisasi selama 1 jam
2. Tuang larutan media ke dalam botol dengan takaran 20 ml/L atau sekitar 2 cm untuk tiap botolnya. Antara mulut bolot dan cerek usahakan tidak saling bersentuhan karena botol telah steril.
3. Tutup mulut botol dengan plastik PP dan eratkan dengan gelang karet. Menutup botol tidak boleh terlalu kencang agar menghindari kerusakan saat botol disterilisasi kembali pada suhu tinggi (121).
4. Botol-botol yang telah terisi larutan media disusun di dalam dandang untuk disterilisasi
5. Siapkan Autoklaf  dan isi air hingga batas yang tertera di dinding autoklaf
6. Masukkan dendeng yang berisi botol-botol media ke dalam autoklaf, lalu tutup rapat penutup autoklaf.
7. Pastikan tombol safety pada autoklaf dalam posisi tertidur dan katup uap dalam posisi berdiri, karena bila katup tertutup, uap dari proses sterilisasi akan terkurung
8. Nyalakan api besar hingga proses pemanasan pada autoklaf mencapai suhu 121 dengan tekanan 17,5 Psi
9. Kecilkan api kompor ketika suhu telah sesuai dan autoklaf menghasilkan banyak uap, dan diamkan selama 30 menit.

 

●       Proses Pengencangan Tutup untuk Media

1. Mengencangkan tutup plastik di bagian leher botol menggunakan satu ikatan karet yang sama dengan sebelumnya, tetapi diikat lagi beberapa kali agar lebih kencang dan rapat
2. Menarik plastik agar tidak ada lagi lekukan atau lipatan, apabila lekukan tersebut tidak dirapikan media tersebut akan mudah terkontaminasi karena udara akan masuk.
3. Mengikat kembali dengan satu karet hingga kencang apabila plastik sudah rapi.
4. Memasukkan botol ke dalam plastik media berukuran 40 x 60 cm, tetapi sebelum dimasukkan plastik tersebut disterilkan atau disemprot menggunakan alkohol 30%.
5. Menyusun botol kultur (botol asi) dengan susunan 6 x 8, satu liter dapat menampung 50 botol asi dan 24 botol selai.
6. Media sudah siap digunakan setelah lima hingga tujuh hari ke depan setelah proses sterilisasi dan pemadatan media. Media tidak dapat digunakan langsung karena belum bisa melihat kontaminasi dari bakteri ataupun jamur sebab media yang terkontaminasi tidak dapat digunakan.

 

     B. Pencucian dan Sterilisasi botol

Alat :

1. Wadah plastik berukuran sedang
2. Botol kultur habis pakai atau media yang telah terkontaminasi
3. Sikat

 

Bahan :

1. Air
2. Detergen
3. Bayclin

 

Langkah Kerja :

1. Membersihkan botol dari media tanam yang terkontaminasi oleh mikroorganisme atau telah digunakan untuk proses pengkulturan.
2. Menuangkan satu tutup botol bayclin ke dalam wadah yang berisikan air.
3. Menuangkan detergen secukupnya ke dalam wadah yang berisikan air dan bayclin hingga berbusa. 
4. Merendam botol-botol kultur yang telah dibersihkan dari media tanam selama 30 menit hingga 1 jam .
5. Menyikat bagian dasar dan sisi botol setelah 1 jam perendaman, hal ini dilakukan agar sisa-sisa media tanam yang terkontaminasi di dalam botol dapat dibersihkan dengan maksimal.
6. Membersihkan bagian sisi luar botol menggunakan spons atau kain untuk cuci gelas atau piring.
7. Botol yang telah disikat dan dibersihkan bagian luarnya kemudian dibilas di air mengalir hingga bersih. 
8. Botol yang sudah dicuci kemudian dilakukan sterilisasi menggunakan autoklaf selama 1 jam dengan suhu 121 .

PLANT INITIATION

  

PLANT INITIATION

Brood quarantine, plant sterilization, and explanatory planting

(ESHA FLORA X IAAS IPB)

Initiation is a technique of obtaining sterile cultures by taking plant explant cultures that go through various sterilization processes. Generally the initiation stage takes from the eyes of the plant buds. Explant sterilization, that is, the process of removing microbes (bacteria, fungi) from plants. The principle of sterilization should be obtaining sterile plants, the right dosage in order for the plant to live and the microbes to die. The most difficult stage of this initiation process is explant sterilization because each plant contains microbes, especially plants to be cultured growing in the tropics. Generally, the percentage of success of the initiation process ranges from 10%.

 

The stages of initiation are as follows ;

1. Brood quarantine

2. Sterilization of pre-laminar explants

3. Sterilization in Laminar

4. Planting

 

1. Parent Quarantine

Parent quarantine is carried out to eliminate the presence of endophytic microbes, fertilize the endurance of the mother plant, and accelerate cell growth. The actions that need to be taken at this stage include:

1. Administration of ZPT or hormones such as auxins, cytokinins, and gibberellin.
2. Application of fungicides and bactericides, such as benlox (fungicide) and agrept (bactericidal).
3. Application of inorganic fertilizers such as gandasil, growmore, and other NPK fertilizers. If the plant is given organic fertilizer, it is worried that it will multiply endophytic bacteria so that inorganic fertilizers are used to strengthen the condition of the broodstock.

 

2. Pre-laminar sterilization

-          Cut into pieces of explants, part of the leaves are cleaned with 70% alcohol

-          Flow the water for 15–30 minutes to remove phenols from the plants and also remove microbes that are still present in the plant explants.

-          Kocok dengan larutan fungisida 0.2 gram dan bakterisida 0.2 gram dalam 100 ml selama 30–60 menit. Tanaman kehutanan membuttuhkan larutan fungisida dan bakterisida yang lebih banyak, yakni umumnya 2 gram dalam 100 ml selama 1 jam.

-          Bilas hingga bersih

-          Rendam dengan larutan antibiotik (Streptomycin) 10 ml dalam 90 ml air steril, lalu di aerator selama 1 jam hingga 16 jam. Aerator yang digunakan di Esha Flora dimodifikasi, aerator dimasukkan ke dalam wadah yang ditutup dengan Hepa filter . Hepa merupakan filter dari laminar yang fungsinya untuk menyaring mikroba sehingga angin atau udara yang masuk bersifat steril.

 

3. Sterilisasi di Laminar

-          Tanaman dibilas air steril

-          Eksplan direndam, kemudian dikocok dalam larutan clorox atau bayclin 15% (7 menit)

-          Perendaman kembali dengan konsentrasi 5% selama 7 menit, dilakukan bertahap agar mengurangi terjadinya kontaminasi dan menghindari terjadi kerusakan jaringan tanaman yang penting.

-          Bilas dengan air steril selama 5 menit

-          Jika tingkat kontaminasi tinggi bisa menggunakan HgCl 10mg/100ml (3-10 meneit). Eksplan yang digunakan pada bagian pucuk muda direndam selama 3 menit sedangkan eksplan yang digunakan pada bagian pucuk tua perendaman bisa mencapai 7 menit .

-          Eksplan dibilas 3 kali dengan air steril masing-masing 5 menit. Harapannya eksplan tanaman benar-benar dalam kondisi steril.

-          Siap ditanam

 

4. Penanaman

Perbedaan penanaman di enkas dan di laminar

-          Enkas : Tidak perlu bunsen dan punya ruang gerak lebih terbatas dibanding laminar, serta ruangan tertutup dan sudah disterilisasi menggunakan alkohol sehingga kemungkinan eksplan terkontaminasi oleh mikroba lebih kecil. Sterilisasi menggunakan alkohol dan air steril yang dicampur dengan betadine.

-          Laminar: Lebih bebas bergerak, dapat menggunakan bunsen untuk pensterilan alat. Selain untuk pensterilan alat bunsen juga digunakan untuk sterilisasi biji anggrek karena inisiasi biji anggrek harus dibakar di dalam laminar. Selain itu, di  laminar juga mempunyai lampu UV yang berguna untuk sterilisasi (membunuh mikroba).

 

 

Proses pengambilan eksplan tanaman

Janda Bolong (Monstera adansonii) dan Puring (Codiaeum variegatum)

 

A.      Sterilisasi luar (sebelum sterilisasi di dalam laminar)

Alat :

1. Gelas ukur
2. Saringan
3. Talenan,
4. Scalpel untuk memotong tanaman.
5. Tisu

Bahan :

1. Air pureit
2. Spray isi alkohol,
3. Fungisida dan bakterisida (masing-masing 0,1 gr + 100 ml air)
4. Deterjen (1 gr larut 100 ml air)
5. Antibiotik yaitu streptomycin (10 ml)

 

Langkah Kerja:

1. Sayat dan ambil batang bertunas Janda bolong, pangkal batang yang berwarna cokelat dan hitam dibersihkan.
2. Untuk tanaman Puring yang diambil ialah daunnya. daun dipotong menjadi bagian-bagian kecil.
3. Kedua eksplan disemprot terlebih dahulu dengan alkohol 70% untuk dibersihkan, kemudian usap menggunakan tisu.
4. Dibersihkan kembali menggunakan air mengalir selama 30 menit
5. Dengan menggunakan pinset, eksplan dimasukkan ke dalam botol berisi deterjen, kemudian botol digoyangkan selama 10 menit.
6. Buang air deterjen, lalu bilas eksplan menggunakan air pureit hingga benar-benar bersih
7. Masukkan eksplan ke dalam botol bakterisida, dan goyangkan botol selama 30 menit
8. Bilas dengan air pureit hingga bersih
9. Kemudian masukkan kembali eksplan ke dalam botol fungisida, dan goyangkan botol selama 30 menit
10. Bilas dengan air pureit hingga bersih
11. Eksplan diberi antibiotik (streptomycin) 10 ml
12. Terakhir dalam proses sterilisiasi luar yakni proses aerator selama 1 jam, proses aerator adalah proses pemberian oksigen kepada tanaman, jika eksplan kurang bersih maka akan muncul busa disekitar eksplan.

 

B.     Sterilisasi dalam laminar

Alat :

1. Tiga botol selai (alkohol + betadine, air steril, dan wadah sampah)
2. Bunsen
3. Cawan petri
4. Pinset
5. Scalpel
6. Tisu steril

 

Bahan :

1. Eksplan tanaman
2. Alkohol
3. Betadine
4. Media tanam
5. Air steril

 

Langkah Kerja :

1. Menyemprot tangan menggunakan alkohol 70% agar tetap steril.
2. Menyiapkan 2 botol selai yang berisi air steril, kemudian memasukkan eksplan ke dalam botol 1 berisi air steril dan dikocok sebanyak 2 kali pengulangan pada botol yang berbeda selama 3 menit. Pengambilan eksplan menggunakan pinset.
3. Menyiapkan larutan HgCl2 10% (10 ml HgCl dicampur dengan 90 ml air steril) yang juga diteteskan tween sebanyak 3 tetes, kemudian eksplan yang sudah disterilkan direndam dan dikocok pada larutan HgCl2 selama 7 menit.
4. Memasukkan eksplan ke dalam air steril, kemudian dikocok selama 5 menit. Proses ini dilakukan sebanyak 2 kali pengulangan pada botol yang berbeda.
5. Memasukkan eksplan ke larutan Clorox 15% atau Bayclin (15 ml Clorox + 85 ml air) kemudian digoyangkan selama 7 menit. Perhatikan kondisi tanamannya apabila sudah memutih kurangi lagi SOP waktunya.
6. Memasukkan eksplan ke dalam air steril, kemudian dikocok selama 5 menit. Proses ini dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan pada botol yang berbeda.

 

Langkah Kerja Penanaman :

1. Menyiapkan cawan petri dan menyalakan bunsen menggunakan korek.
2. Memasukkan eksplan ke dalam air steril, kemudian dikocok selama 5 menit. Proses ini dilakukan sebanyak 2 kali pengulangan pada botol yang berbeda.
3. Cawan petri diberikan betadine dan alkohol 70% kemudian digoyang-goyangkan sampai betadinenya merata (bisa digoyangkan dalam posisi terbalik).
4. Cawan petri dibersihkan menggunakan tisu steril, kemudian cawan petri dibakar menggunakan bunsen.
5. Memasukkan tisu steril ke dalam cawan petri, tisu ini akan digunakan sebagai tempat atau wadah eksplan. Kondisi cawan petri diusahakan harus selalu dalam kondisi tertutup. 
6. Membakar ujung pinset menggunakan bunsen setiap akan digunakan, kemudian pinset tersebut dimasukkan ke larutan betadine. Apabila terdapat bagian ujung eksplan tanaman berwarna putih, maka harus dilakukan pemotongan.

7. Menyiapkan media tanam, air yang ada di media dibuang, kemudian mulut botol  dibakar dengan bunsen dan bagian ujung pinset jangan menyentuh mulut botol atau media tanamnya.
8. Memasukkan eksplan ke dalam media menggunakan pinset, posisi pinset miring, dan posisi tunas Janda bolong menghadap ke atas (tunas di atas) sedangkan eksplan Puring ditanam dengan posisi daunnya langsung ditancapkan atau tulang daunnya yang ditancapkan ke media tanam.

 

+ Proses Wrapping eksplan yang sudah ditanam pada media

Sebelum eksplan dimasukkan pada ruang inkubasi, botol eksplan dibungkus terlebih dahulu dengan plastik wrapping ;

-          Botol selai : hanya dengan membungkus pinggiran tutup botol dengan plastik wrap

-          Botol asi : setelah dikencangkan dengan karet, tutup botol harus menggunakan aluminium foil baru kemudian dibungkus dengan plastik wrap

 

+ Proses pelabelan botol eksplan

Botol eksplan yang siap dimasukkan ke dalam ruangan inkubasi terlebih dahulu diberi label. Adapun ketentuan pelabelan ialah dengan mencantumkan nama tanaman, tanggal inisiasi, media serta eksplan yang digunakan.