Tentang Kultur Jaringan

KULTUR JARINGAN TANAMAN

Oleh
Ir. Edhi Sandra MSi
1. Kepala Unit Kultur Jaringan Bagian Konservasi Keanekaragaman Tumbuhan, Bagian Konservasi Sumberdaya Hutan Dan Ekowista Fakultas Kehutanan IPB Bogor.
2. Kepala laboratorium Bioteknologi Lingkungan PPLH LPPM IPB Bogor
3. Pemilik Esha Flora, Plants And Tissue Culture

Pendahuluan

Teknologi kultur jaringan tanaman (Plant Tissue culture) sudah ada sejak lama, tapi di kalangan masyarakat Indonesia masih banyak yang tidak mengetahui, tidak mengenal dan tidak memahami apa yang dimaksud dengan kultur jaringan tanaman. Demikian pula pada saat kami sedang membawa kultur tanaman di dalam botol di luar maka banyak dari mereka yang terheran-heran melihat tanaman dapat tumbuh di dalam botol.

Pada sebagian kalangan yang sudah pernah melihat dan mendengar maka pengertian mengenai kultur jaringan juga sepenggal-sepenggal sehingga tidak menggambarkan persepsi yang benar mengenai kultur jaringan tanaman. Demikian pula dengan yang sudah mempelajari juga memiliki pemahaman dengan kadar yang berbeda-beda. Secara umum dari kalangan yang pernah mempelajari kultur jaringan maka mereka hanya mengetahui bahwa kultur jaringan tanaman hanya untuk memperbanyak tanaman saja.

Sebenarnya literature dan buku-buku tentang kultur jaringan tanaman juga sudah ada di kalangan masyarakat, tapi terkesan sangat teknis dan sulit sehingga, kebanyakan dari masyarakat memutuskan bahwa kultur jaringan adalah sulit, mahal dan lama hasilnya.

Oleh sebab itulah maka kami merasa perlu untuk menguraikan hal-hal kecil, sederhana tapi sangat penting terkait persepsi dan pemahaman tentang kultur jaringan tanaman. Dalam uraian ini sengaja kami berusaha menggunakan bahasa yang lebih mudah dipahami masyarakat luas agar dapat lebih mudah dicerna dan dimengerti. Dalam uraian ini menampilkan hal-hal yang seringkali ditanyakan oleh banyak orang.

Tujuan 

Tujuan tulisan ini adalah agar masyarakat lebih mengetahui, lebih memahami, lebih mencintai, dan mampu menerapkan teknologi kultur jaringan dalam bidangnya sehingga memberikan peningkatan keuntungan dan manfaat lainnya.

Kultur Jaringan Tanaman

Adalah suatu teknologi membudidayakan tanaman di dalam botol dalam kondisi steril, dengan kondisi lingkungan yang memadai dan media kultur yang sesuai untuk pertumbuhan tanaman.

Kenapa harus steril ? 

karena media kultur jaringan sedemikian lengkapnya terdiri juga dengan bahan organik seperti vitamin, asam amino, hormone dll,  sehingga bila tidak steril maka yang akan tumbuh terlebih dahulu adalah mikroba. Hal inilah yang membuat teknologi kultur jaringan sangat sulit, karena tidak mudah menyediakan bahan eksplan (bagian tanaman yang akan di kulturkan) dalam kondisi steril. Sedemikian lengkap dan tepat komposisinya  maka media kultur jaringan mampu menumbuhkan sepotong jaringan tanaman sekalipun. 

Bagian apa dari tanaman yang dapat digunakan sebagai bahan eksplan (bagian tanaman yang ditanam di dalam botol kultur) ?

Jawabannya adalah bahwa secara teoritis ilmiah semua bagian tanaman bisa digunakan sebagai bahan eksplan untuk ditanam di dalam botol kultur, dengan syarat jaringan tanaman tersebut masih hidup. Dalam praktek realnya banyak pelaku kultur jaringan tidak mampu atau tidak sanggup mengkulturkan bagian tanaman tertentu.

Kenapa bisa terdapat perbedaan antara teoritis dan realitanya? Karena secara teoritis sudah sangat jelas prinsip dasar dari semua sel atau jaringan dapat dikulturkan yaitu prinsip TOTIPOTENSI (Total Genetik Potensi) yang terdapat pada setiap sel tanaman, artinya bahwa setiap sel tanaman yang masih hidup cukup untuk menumbuhkan individu baru dari tanaman tersebut. Hal ini disebabkan bahwa di dalam setiap sel tanaman terdapat rangkaian genetik yang lengkap untuk membentuk individu baru yang utuh. 

Lalu kenapa realitanya banyak pelaku kultur jaringan tidak sanggup mengkulturkan beberapa jaringan tanaman tertentu? Hal ini disebabkan bahwa terdapat perbedaan antara sel tumbuhan dengan sel hewan dan manusia. Sel tumbuhan memiliki dinding sel selain membran sel, sedangkan sel hewan dan manusia tidak memiliki dinding sel. Dinding sel pada tanaman ini akan mengalami penebalan pada saat sel tersebut dewasa dan tua. Penebalan dinding sel inilah yang menyebabkan sulitnya sel tersebut membelah dan memperbanyak diri. Itulah sebabnya ada beberapa eksplan tidak mau tumbuh, tidak mau membelah dan memperbanyak diri. Oleh sebab itulah maka bahan eksplan menggunakan sel-sel yang belum mengalami penebalan dinding sel. 

Bahan Eksplan Yang Baik

Adalah  bahan eksplan yang berasal dari bagian tanaman yang belum mengalami penebalan dinding sel. Bila kita ingat pelajaran biologi maka pertumbuhan sel terbagi atas : membelah, membesar, menebal atau dan berdiferensiasi. Sel yang telah mengalami penebalan adalah sel kolenkim dan sklerenkim sedangkan sel yang belum mengalami penebalan dan diferensiasi adalah sel parenkim. Sel parenkim inilah sel-sel yang baik untuk dikulturkan karena akan mudah untuk membelah dan bermultiplikasi.

Sel-sel parenkim terdapat pada bagian tanaman yang masih muda, seperti pucuk, kuncup, tangkai muda, akar muda, pentil buah dll. Tapi secara garis beasar maka bahan eksplan dapat dipilah berdasarkan tingkat kemudahan untuk dikultur adalah : 1. Titik tumbuh, 2. Primordial tunas, 3. Embrio, 4. Biji, 5. Jaringan muda, 6. Jaringan dewasa, 7. Jaringan berdiferensiasi, 8. Jaringan tua.

Umur sel yang muda sangat penting dalam pemilihan bahan eksplan, karena selain  menandakan bahwa sel tersebut belum mengalami penebalan, di sisi lain juga terkait pada rendahnya kandungan metabolit sekunder berdampak pada permasalahan browning (pencoklatan). Pencoklatan bisa disebabkan oleh karena sel eksplan tersebut memang mengeluarkan zat metabolit sekunder (sejenis etanol) yang akan bereaksi dengan oksigen dan membentuk senyawa quinon (berwarna coklat), atau bisa juga disebabkan bahan eksplan tersebut terinvasi oleh larutan fenol dari induknya sehingga eksplan tersebut mengalami browning saat di inisisasi.

Tahapan Kultur Jaringan

Secara garis besar maka kegiatan teknis kultur jaringan dapat dipilah menjadi:

1. Persiapan Laboratorium Kultur Jaringan

1.1. Tata letak

1.2. Kebutuhan ruangan

1.3. Kapasitas produksi

1.4. Ragam tujuan

2. Persiapan bahan,  Alat dan Media Kultur Jaringan

3. Sterilisasi Besar Laboratorium Kuljar pertama kali (Ho operasional Lab Kuljar)

3.1. Sterilisasi besar

3.2. Memberlakukan aturan dan tata tertib

3.3. Hanya orang tertentu yang dapat masuk ke dalam ruang kultur

4. Persiapan bahan eksplan

4.1. Karantina indukan bahan eksplan

4.2. Perendaman antibiotik / antiseptic sistemik

5. Inisiasi  (Titik kritis dalam tahapan kultur jaringan, keberhasilan 0 -10% saja)

5.1. Persiapan eksplan

5.2. Sterilisasi luar laminar

5.3. Sterilisasi dalam laminar

5.4. Inokulasi eksplan

6. Subkultur

6.1. Penyelamatan

6.2. Perbanyakan

6.3. Permudaan

6.4. Perlakuan

7. Multiplikasi

7.1. Kalus

7.2. Embrio somatic

7.3. Stek mata tunas

7.4. Kloning (shaker)

8. Pemanjangan/pembesaran 

9. Perakaran

10. Aklimatisasi

10.1 Normalisasi hormone

10.2 Hardening

10.3 Pemindahan dalam sungkup berlapis

11. Pemindahan ke dalam polibag

12. Bibit siap tanam

Permasalahan Teknis Kultur Jaringan
1. Kontaminasi
2. Browning
3. Viabilitas
4. Aklimatisasi

Permasalahan Non Teknis Kultur Jaringan
1. Pemasaran
2. Sumberdaya Manusia
3. Manajemen

Media Kultur Jaringan Tanaman

Media kultur jaringan tanaman sudah banyak para peneliti yang membuat formulanya,  Misalnya: Murashige and skoog (MS) adalah media kultur jaringan tanaman yang paling luas penggunaannya bisa digunakan untuk berbagai jenis tanaman, Vacin and Went (VW) adalah media kultur jaringan untuk anggrek, Wood Plant Media (WPM) adalah media kultur jaringan untuk pohon, dll. Media yang sudah diformulasikan oleh para peneliti ini disebut sebagai media baku. Dalam literature tertulis komposisi dan takarannya, kita dapat membuat sesuai dengan ukuran tersebut, memang cukup merepotkan bagi pemula. Tapi saat ini sudah ada media yang sudah diramu lengkap, sehingga konsumen tinggal pakai.

Penamaan Media Modifikasi

Media kultur jaringan yang digunakan para praktisi menggunakan media baku tapi dengan kondisi tertentu atau ditambahi dengan hormon tertentu. Misalnya: MSo maksudnya adalah media kultur Murashige and Skoog dengan tidak menggunakan hormon. MS BAP 2 maksudnya adalah media kultur Murashige and Skoog dengan menggunakan hormon sitokinin BAP 2 mg/liter.

Disamping itu media modifikasi bisa dilakukan dengan merubah takaran beberapa komponen ramuan disesuaikan dengan kebutuhan tanaman. Perubahan komponen bisa berasal dari perubahan unsur hara, vitamin, atau asam amino. Bisa pula modifikasi dilakukan dengan menambahkan bahan organik ke dalam media baku misalnya menambahkan air kelapa pada media Vacin and Went. Menambahkan ekstrak kentang pada media Murashige and Skoog.

Sebenarnya dengan mengacu pada komposisi dan formula media baku, maka kita dapat membuat sendiri media kultur jaringan sendiri. Esha Flora membuat media alternative kultur jaringan dan media organik kultur jaringan.

Modifikasi Media Kultur Jaringan

Modifikasi media kultur jaringan biasanya disesuaikan dengan tujuan yang diinginkan. Harapannya modifikasi media tersebut dapat mewujudkan tujuan yang diharapkan. Oleh sebab itulah maka ada berbagai istilah dalam media kultur jaringan:

1. Media inisiasi

2. Media kalus

3. Media multiplikasi

4. Media embrio somatik

5. Media pembesaran

6. Media perlakuan

7. Media perakaran

8. Media mutasi

9. Media poliploid

10. Media variegata

11. Media metabolit sekunder

12. Media konservasi in vitro

Kapan Subkultur Dilakukan ?

Pertanyaan tersebut seringkali ditanyakan oleh banyak orang.  Tidak ada keharusan bahwa subkultur harus dilakukan setelah sekian bulan dan sebagainya. Waktu dilakukannya subkultur dapat berbeda-beda tergantung tujuan dan kondisi yang ada.

Bila tujuannya adalah secepat-cepatnya jumlah multiplikasi yang dihasilkan maka setiap kali ada pertumbuhan tunas atau embrio somatik maka dilakukan subkultur, dalam hal ini maka subkultur dapat dilakukan sekitar 2- 3 minggu. Subkultur yang relative cepat ini dapat dilakukan bila jumlah tenaga kerja memadai atau jumlah kultur yang harus di subkultur tidak terlalu banyak. Dilain pihak bila tidak ada tenaga kerja yang memadai maka subkultur dapat dilakukan setiap 2 – 3 bulan sekali. 

Ada pula subkultur yang dilakukan setelah media kultur “habis” dan kultur tanaman perlu di rejouvenilisasi. Dalam kondisi ini subkultur dapat dilakukan 6 -9 bulan. Hal ini akan sangat menghemat tenaga kerja, tapi disisi lain jumlah perbanyakan sangat rendah. Ini dimungkinkan bila tujuannya memang untuk koleksi saja.

Kecepatan Multiplikasi

Kecepatan multiplikasi adalah kemampuan kultur tanaman di dalam memperbanyak dirinya dalam satuan waktu tertentu. Hal ini memang sangat tergantung pada jenis dan komposisi media (khususnya hormon yang digunakan).

Misalnya disebutkan bahwa kultur tanaman pisang mempunyai kecepatan multiplikasi 1 eksplan menjadi  35 eksplan/ 3 bulan. Disisi lain kultur tanaman pisang juga bisa memiliki kecepatan multiplikasi yang berbeda yaitu 1 eksplan menjadi 10 eksplan/ 1,5 bulan. 

Lalu kalau di tanya mana yang lebih bagus? Maka jawabannya tergantung tujuan dan kondisi. Bila kultur jaringan tersebut dilakukan oleh pemiliknya sendiri hanya sekedar hobi, dilakukan disela-sela waktu kerjanya maka yang sangat dimungkinkan adalah subkultur setiap 3 bulan dengan kecepatan multiplikasi 1 eksplan menjadi 35 eksplan. Tapi bila suatu perusahaan yang memilki tenaga kerja yang memadai , dana yang memadai target pasar terbuka, maka dalam hal ini yang paling baik adalah subkultur setiap 1,5 bulan dengan kecepatan multiplikasi 1 eskplan menjadi 10 eskplan. Bila disamakan waktunya untuk 3 bulan maka jumlah perbanyakan multiplikasi menjadi 1 menjadi 10, kemudian dalam waktu 1,5 bulan berikutnya 10 x 10 eksplan maka menjadi 100 eskplan. Berarti dalam 3 bulan yang sama bila dilakukan subkultur setiap 1,5 bulan akan dihasilkan 100 eksplan, bila subkultur 3 bulan hanya dihasilkan 35 eksplan.

Bahkan bisa dipercepat lagi. Bila ternyata kultur pisang tersebut disubkultur dalam waktu 1 bulan dihasilkan 5 eksplan, maka dalam waktu yang sama yaitu 3 bulan dapat dihasilkan jumlah multiplikasi: 1 menjadi 5. Dari 5 menjadi: 5 x5 eksplan : 25 eksplan. Dari 25 eksplan menjadi : 25 x 5 eskplan : 125 eksplan. Lebih banyak 25 eskplan bila dibandingkan dengan subkultur setiap 1 bulan.

Kinerja Subkultur Pekerja Dalam Satu Hari

Kemampuan tenaga kerja dalam melakukan subkultur dalam satu hari, maka bila tenaga kerja tersebut dibebani oleh semua pekerjaan kultur jaringan maka ia hanya mampu melakukan 50 botol kultur/ hari. Tapi bila tenaga kerja tersebut spesial hanya melakukan subkultur maka tenaga kerja terampil dapat melakukan subkultur sebanyak 200 – 300 botol kultur / hari (3-5 eksplan/botol kultur). Bila satu botol kultur berisi 5 eksplan maka jumlah kultur yang dihasilkan per hari adalah 5 kultur x 300 botol = 1.500 kultur/ hari. 

Titik Kritis Dalam Kultur Jaringan Tanaman

Titik kritis dalam usaha kultur jaringan tanaman adalah pada tahapan inisiasi, terutama untuk jenis-jenis baru yang belum pernah dikulturkan. Keberhasilan inisiasi berkisar 0 – 10%. Bila kita hanya mempunyai bahan eksplan hanya satu maka peluangnya sama dengan nol. Demikian pula bila kita mencoba sebanyak 5 eksplan, tetap saja peluangnya nol. Bila kita mencoba 10 bahan eksplan, maka peluangnya 1 eksplan. Tapi hal ini barulah peluang saja karena seringkali tidak berhasil.

Mengatasi Kontaminasi Dalam Inisiasi

Kesulitan mengatasi kontaminasi pada saat inisiasi adalah disebabkan oleh banyaknya akumulasi mikroba yang mengendap dan mengkristal pada bagian permukaan bahan eksplan serta adanya kandungan mikroba secara sistemik, yaitu adanya mikroba di dalam eksplan tersebut. Padahal dalam berbagai literature, prosedur sterilisasi yang ada baru mengantisipasi kontaminasi permukaan eksplan saja, tidak ada prosedur yang berusaha untuk mengantisipasi kontaminasi yang berasal dari dalam eksplan tersebut, kalaupun ada maka prosedur tersebut masih jauh dari sempurna untuk dapat menghilangkan mikroba dari dalam eksplan.

Oleh sebab itulah maka yang perlu diingat bahwa sterilisasi harus mencakup kedua hal tersebut yaitu sterilisasi permukaan eksplan dan sterilisasi sistemik dari dalam eksplan. Dari pemahaman tersebut kemudian dijabarkan dalam bentuk prosedur yang dapat mengantisipasi permasalahan yang di timbulkan dari kontaminasi permukaan dan kontaminasi sistemik. Kontaminasi sistemik sulit dihilangkan karena posisi dan letak mikroba tersebut yang berada di dalam eksplan tersebut dan untuk dapat bisa masuk sampai pada mikroba di dalam eksplan tersebut bukanlah hal yang mudah karena setiap mahluk hidup dalam hal ini eksplan tanaman memiliki struktur morfologi dan sistem fisiologi yang membuat tidak semudah itu suatu zat dapat masuk ke dalam suatu bagian tanaman tanpa memperhatikan factor morfologi dan fisiologi tersebut. Disamping itu juga zat yang dimasukkan ke dalam bahan eksplan tersebut haruslah bahan yang tidak mematikan eksplan tapi dapat mematikan mikroba.

Seringkali terjadi kondisi bahwa mikroba lebih kuat dibandingkan baggian eksplan yang akan dikulturkan. Lemahnya bahan eksplan terhadap bahan desinfektan adalah disebabkan bahan eksplan tersebut sudah berupa bagian tanaman yang terpotong dari individunya. Hanya merupakan sepotong bagian tanaman yang hanya memiliki sebagian cadangan makanan, dengan kondisi fisiologis yang stress karena terpotong dan ketidak tersediaannya factor –faktor yang dapat memulihkan kondisinya seperti vitamin, hormone asam amino, mineral dll.

Oleh sebab itulah maka Esha Flora menarik mundur proses sterilisasi sistemik di lakukan pada saat bahan eksplan belum dipotong yaitu masih terdapat pada bahan indukan eksplan yang berupa, bibit mudah, atau hasil cangkokan, atau hasil stekkan atau bahan tanaman yang masih hidup, kemudian diberi perlakuan prosedur menghilangkan mikroba sistemiknya. Dengan demikian karena bahan eksplan tersebut masih berada pada induknya, dan tidak pada kondisi stress diharapkan bahan eksplan tersebut akan lebih kuat dalam  menghadapi zat desinfektan yang diberikan. Proses ini kami sebut dengan proses karantina bahan indukan eksplan. Jadi tujuan karantina dalam hal ini berbeda dengan karantina yang dimaksudkan dalam pertanian di lapang secara umum, tapi karantina dalam hal ini bertujuan menghilangkan kandungan mikroba dari dalam bahan eksplan.

Beberapa alternative zat yang dapat digunakan untuk bahan sterilisasi:
1. Sterilisasi permukaan: alkohol, klorok/ bayclean, HgCl, betadine, deterjen
2. Sterilisasi sistemik : antibiotik, PPM (Plant Preservative mixture), ekstrak bawang putih, antiseptik sistemik

Antibiotik yang digunakan haruslah yang memiliki spectrum luas atau yang dapat mematikan semua mikroba, baik bakteri maupun cendawan/jamur. Oleh sebab itu dapat digunakan gabungan dari berbagai antibiotic seperti: amoxicillin, streptomicine dan kloramfenicol. Bisa pula menggunakan gabungan antara: ketoconazole (untuk mematikan cendawan/jamur) dan ciprofloxacin (untuk mematikan bakteri). Atau bisa pula dicobakan dengan antibiotik dan antisaptik spectrum luas seperti Levocine atau Feracrytum (Hemolok).

Mengatasi Browning (Pencoklatan)

Untuk mengatasi browning maka ada berbagai prosedur yang dapat dilakukan:
1. Pemilihan bahan eksplan 
1.1.  Eksplan muda.
Gunakan eksplan yang muda agar eksplan mudah bermultiplikasi dan tidak atau belum memproduksi fenol yang dapat bereaksi dengan oksigen menjadi quinon (berwarna coklat)

1.2.  Bahan indukan eksplan muda. Dari pohon induk besar di rejouvenilisasi dengan cara di stek, atau dicangkok atau di sambung

2. Pembersihan / pembuangan kandungan fenol dari dalam bahan eksplan
Dengan menggunakan air mengalir, menggunakan ozoniser.

3. Mencegah terbentuknya quinon
Menggunakan bahan antioksidan, seperti vitamin C, asam askorbat, cuka makan, carbonasi.

4. Mengurangi produksi fenol dari dalam eksplan
Mengkondisikan agar kondisi lingkungan tidak merangsang terbentuknya fenol, seperti bahan desinfektan yang tidak terlalu keras, sinar yang redup/ gelap, suhu rendah. Kondisi tersebut dilakukan sampai luka eskplan sembuh.

Kalau mengkulturkan suatu tanaman, kapan hasil kultur bisa di dapat?

Pertanyaan ini seringkali ditanyakan oleh masyarakat umum yang ingin mengkulturkan tanaman kesayangannya atau tanaman langka yang prospek untuk dijual. Pertanyaan ini sebenarnya menggambarkan bahwa penanya tersebut tidak memahami kultur jaringan tanaman. Pada pembahasan diawal sudah disampaikan tahapan di dalam kultur jaringan. Bila pertanyaan tersebut ditujukan pada tanaman yang belum pernah di kulturkan, atau tanaman tersebut harus diinisiasi terlebih dahulu, dan tanaman tersebut keberadaannya sangat terbatas baik karena langka atau harganya yang sangat mahal, berdampak pada sedikitnya bahan eksplan yang dapat digunakan. Dalam hal ini maka akan sulit untuk berhasil melewati tahap inisiasi, karena inisiasi adalah tahap kritis dalam kultur jaringan tanaman. Bila pertanyaan tersebut ditujukan pada tanaman yang belum pernah dikultur maka waktu yang diperlukan untuk dapat menghasilkan bibit siap tanam di luar lab adalah sekitar 2- 3 tahun. Bila ternyata tidak sulit inisiasinya maka diperlukan waktu sekitar 1- 1,5 tahun.

Disisi lain bila pertanyaan tersebut ditujukan pada tanaman yang sudah ada stok dalam kultur sterilnya maka waktu yang diperlukan tergantung pada jumlah awal kultur sterilnya bila jumlah awal kultur steril besar maka kemungkinan hanya satu kali subkultur jumlah sudah terpenuhi sehingga bisa langsung di aklimatisasi dalam hal ini waktu yang diperlukan untuk menghasilkan bibit siap tanam diluar laboratorium sekitar 4 – 9 bulan.

Bila kita ingin agar terjadi kesinambungan produksi bibit kultur jaringan yang siap tanam, maka perlu dibuat tahapan rotasinya. Secara garis besar di bagi menjadi 4 kelompok:

1. Tahapan multiplikasi

2. Tahapan pembesaran & perakaran

3. Tahapan aklimatisasi

4. Tahapan pembesaran dalam polibag.

Masing-masing-masing waktu sekitar 3 bulan jadi agar berkelanjutan diperlukan 3 bulan x 4 tahapan = 12 bulan.

Ingin belajar mengenai kultur jaringan? Bisa mengikuti Pelatihan Kultur Jaringan di Esha Flora